کیت سنتز cDNA

کیت سنتز  cDNA

عبارت cDNA برگرفته از لغت  complementary DNA است که به واسطه ی حضور آنزیم ترانس کریپتاز معکوس ( Reverse transcriptase ) ساخته می شود . این آنزیم با کمک از توالی نوکلئوتیدی RNA ، مکمل DNA  یا cDNA را در قرینه ی آن قرار می دهد .

سنتز cDNA

در آزمایشات بررسی بیان ژن، یا کلونینگ یک ژن یوکاریوتی یکی از مهمترین مراحل کار تبدیل RNA استخراج شده به DNA است. این فرایند که توسط آنزیم ریورس ترانس کریپتاز (Reverse Transcriptase) با حضور برخی ترکیبات و پرایمر مخصوص فرایند cDNA سازی انجام می‌شود در حضور بافر، آنزیم مهارکننده RNAse و پرایمر مخصوص ساخت cDNA انجام می‌شود.

جزء اصلی این واکنش آنزیم M-MLV RT است که حاصل بیان ژن ترانس کریپتاز Murine Leukemia Virus به صورت نوترکیب در باکتری اشرشیا کلای است. این آنزیم میتواند رشته مکمل تک رشته RNA یا DNA را در حضور پرایمر اختصاصی سنتز کند.

ترکیبات کیت سنتز cDNA آناسل

1. M-MLV Reverse Transcriptase Enzyme

2. 5x Buffer

3. Oligo(dT)18 primer

4. Random hexamer primer

5. RNasein 40u/μl

6. dNTP 10mM

توضیحات

1. در سنتز cDNA دو نکته بسیار حائز اهمیت است؛ انتخاب نوع پرایمر و آنزیم رونوشت بردار معکوس. عموماً پرایمر های Random hexamer وOligo (dt)  در سنتزCDNA مورد استفاده قرار می گیرند. در کمی سازی تعداد رونوشت های RNA، رونویسی معکوس یک مرحله اساسی است که در آن رونوشت های RNA به عنوان الگو، برای سنتز cDNA مورد استفاده قرار می گیرد. ظهور کیت های سنتزcDNA رونوشت برداری معکوس را ساده تر و سریع تر نموده است که منجر به تولید یک محصول با کیفیت می شود. دو الزام مهم برای انتخاب یک کیت سنتز cDNA مناسب، نوع پرایمرها و آنزیم رونوشت بردار معکوس می باشد.

2. پرایمرهای مورد استفاده در این مرحله یا oligo(dT) هستند یا Random hexamer. در شرایط خاصی ممکن است پرایمرهای اختصاصی نیز استفاده شود. Oligo(dT) توالی های تکراری حاوی باز تیمین هستند. این پرایمرهای توانایی اتصال به دم poly-A در انتهای رشته های mRNA را دارند.

3. پرایمر Random hexamer، توالی هایی با 6 باز و با توالی های اتفاقی هستند که می توانند به هر جایی در هر رونشت RNA متصل شده و محل آغاز فعالیت آنزیم رونوشت بردار معکوس را فراهم کنند. سنتز cDNA با استفاده از پرایمرهای اختصاصی بالاترین اختصاصیت را ایجاد می کند، با این حال، cDNA سنتز شده با استفاده از پرایمرهای اختصاصی برای سایر آزمایشات قابل استفاده نیست.

4. آنزیم رونوشت بردار معکوس فعالیت های متعددی دارد. فعالیت DNA پلی مرازی وابسته به RNA این آنزیم، مسئول ساخت رشته‌ی اول cDNA می باشد. آنزیم نسخه بردار معکوس همچنین دارای خاصیت DNA پلی مرازی وابسته به DNA هست. خاصیت سوم این آنزیم، فعالیت نوکلئازی شامل RNaseH است که منجر به تخریب RNA موجود در هیبرید RNA-DNA می شود. در کیت های مختلف، از دو نوع آنزیم رونوشت بردار معکوس استفاده می شود.