کیت وسترن بلات

کیت وسترن بلات

وسترن بلاتینگ که همچنین به ایمونوبلاتینگ یا پروتئین بلاتینگ شناخته شده است، یکی از تکنیک‌های کلیدی در زیست شناسی سلولی و مولکولی است و معمولاً برای شناسایی حضور پروتئین خاصی در مجموعه‌ای از پروتئین‌های سلولی بکار می‌رود. این روش یک آزمایش تأییدکننده است و وجود آنتی بادی علیه آنتی ژن را بررسی می‌کند. این روش بیشتر در تأیید نتایج مثبت شده تست الیزا بکار می‌رود. تست وسترن بلات در همراهی با تست الیزا بیش از ۹۹% مورد اطمینان خواهد بود. امروزه برای بسیاری از عفونت های ویروسی و باکتریایی تست تایید وسترن بلات موجود است.

وسترن بلات (پروتئین بلاتینگ یا ایمنو بلاتینگ) یک روش بسیار قدرتمند و مهم برای شناسایی ایمنی پروتئین ها است. از وسترن بلات اغلب در تحقیقات برای جداسازی و شناسایی پروتئین ها استفاده می شود.

 این تکنیک شامل ۳ مرحله می باشد

1. جداسازی پروتئین ها بر اساس اندازه

2. انتقال به غشاء جامد

3. نشاندار کردن پروتئین هدف با آنتی بادی اولیه و ثانویه مناسب جهت تشخیص

وسترن بلات انتقال پروتئین از ژل SDS-PAGE به غشا را امکان پذیر می کند. پروتئین های بلات شده یک کپی دقیق از ژل را تشکیل می دهند . با استفاده از این روش شناسایی اختصاصی پروتئین هدف با آنتی‌بادی مناسب صورت می گیرد. ارزش قدرت تفکیک بالای ژل الکتروفورز تنها پس از ظهور وسترن بلات به کامل ترین پتانسیل خود رسید. انتقال موثر پروتئین ها از ژل به غشاء جامد بستگی زیادی به ماهیت ژل، جرم مولکولی پروتئین های منتقل شده و غشای مورد استفاده دارد.

مرحله ۱: استخراج پروتئین در تکنیک وسترن بلات

برای وسترن بلات، آماده سازی نمونه یک گام اساسی در فرآیند وسترن بلات است. تیمار مناسب نمونه ها تضمین می کند که شما قادر به شناسایی پروتئین های مورد نظر هستید. پروتئین را می توان از انواع مختلف نمونه ها مانند بافت یا سلول ها استخراج کرد.

استخراج پروتئین از نمونه های سلولی

ابتدا سلول ها را تریپسینه کرده و به صورت معلق در آورده و سپس لیز سلول ها با استفاده از یک بافر لیز کننده همراه با مهار کننده پروتئاز انجام می شود. محلول لیز را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را جمع کرده و در نهایت مایع رویی (یا مخلوط پروتئین) را به یک لوله تازه منتقل می کنیم که باید روی یخ نگهداری شود یا در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد منجمد شود.

استخراج پروتئین از نمونه های بافتی

ابتدا بافت های جامد را هموژنایز کرده و سپس لیز بافت ها با استفاده از بافر لیز کننده همراه با مهار کننده پروتئاز انجام می شود در نهایت محلول لیزر را سانتریفیوژ کرده و مایع رویی را جمع کرده و در نهایت  مایع رویی (یا مخلوط پروتئین) را به یک لوله تازه منتقل کنیم که باید روی یخ نگهداری شود یا در دمای ۲۰- درجه سانتیگراد منجمد شود.

تعیین غلظت پروتئین ها

در نهایت غلظت پروتئین با استفاده از روش براد فورد یا تکنیک لوری تخمین زده می شود.

مرحله ۲: آماده سازی ژل و نمونه ها و لود کردن آنها در چاهک و ران شدن توسط دستگاه الکتروفورز

در این مرحله ابتدا آماده سازی ژل انجام می شود. ژل از دو بخش separation gel و stacking gel تشکیل شده است درصد انتخاب شده در این نوع ژل به اندازه پروتئین هدف بستگی دارد. پس از آماده سازی ژل نمونه ها را به همراه بافر نمونه به مدت ۵ دقیقه در ۱۰۰ درجه سانتیگراد حرارت داده می شود و سپس در چاهک های ژل تزریق می شوند و در نهایت پس از اتمام الکتروفورز، پروتئین‌ها بر روی ژل SDS-PAGE بر اساس اندازه تفکیک می شوند.

مرحله ۳: انتقال پروتئین‌ها از ژل به غشاء در تکنیک وسترن بلات

در مرحله ترانسفر، پروتئین‌های تفکیک ‌شده بر روی ژل به کاغذ PVDF بصورت پیوسته و مرطوب منتقل می شود. بدین منظور ابتدا مقداری از بافر انتقال را در یک ظرف تمیز ریخته و ژل را پس از بریدن بخش متراکم کننده آن در بافر قرار می دهیم. کاغذ PVDF را ابتدا در متانول و سپس در بافر انتقال خیس می کنیم همچنین چندین پد صافی را که دقیقا هم اندازه ژل برش دادیم و دو عدد اسفنج را که قرار است در طرفین غشا و ژل قرار بگیرند را در بافر انتقال قرار می دهیم تا کاملا خیس شود. سپس اجزای فوق را رو هم قرار می دهیم. کاغذهای صافی به تعداد مساوی به همراه یک اسفنج را در دو طرف غشا و ژل قرار داده و نهایتا ساندویچ بلات را در قاب پلاستیکی مربوطه محکم می کنیم و در تانک بلات که تا ارتفاع مناسب با بافر پر شده است، قرار می دهیم. در این مرحله تانک وسترن بلاتینگ بهتر است که در مخزنی از یخ قرار گیرد تا گرمای ناشی از جریان ، در پروسه انتقال خللی ایجاد نکند. (نکته: اطمینان حاصل می کنید که هیچ حباب هوایی بین ژل و غشای PVDF وجود نداشته باشد و مایعات اضافی را فشار می دهیم تا خارج شوند).

مرحله ۴: بلاکینگ و تشخیص با آنتی بادی اولیه و ثانویه

1. پس از اتمام مرحله ترانسفر، کاغذ PVDF به منظور حذف اتصالات غیر اختصاصی و جهت تشخیص اختصاصی در محلول بلاکر به مدت یک ساعت قرار می گیرد از BSA و یا شیر خشک بدون چربی می توان برای این کار استفاده کرد

2. غشای  PVDF را در محلول آنتی بادی اولیه با رقت مناسب به مدت یک شبانه روز در ۴ºC  بر روی شیکر قرار می دهیم تا انکوبه شود.

3. سه بار شستشو غشاء با TBST به مدت ۵ دقیقه انجام می شود.

4. غشای  PVDF را در محلول آنتی بادی ثانویه کانژوگه شده با آنزیم (alkaline phosphatase or horse radish peroxidase) با رقت مناسب به مدت ۵/۱ بر روی شیکر قرار داده تا انکوبه شود .

5. سه بار شستشو غشاء با TBST به مدت ۵ دقیقه انجام می شود.

مرحله ۵: شناسایی با روش (Electrochemiluminescence)ECL و ظهور باندها بر روی فیلم  x-Ray

ابتدا به نسبت مساوی از دو محلول کیت ECL را بر روی کاغذ PVDF ریخته (نکته: برای اطمینان از پوشش ECL از پیپت ۱۰۰۰ میکرولیتر استفاده کنید) و سپس باندها بر روی فیلم X-RAY قابل مشاهده هستند توجه شود که تمامی این مراحل باید در تاریکی انجام شود.